FNC（阿兹夫定）：一种先进的抗癌疗法还是只是一个失败者？
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这是一篇最新发表在国外肿瘤学杂志的文章，阿兹夫定不仅是治疗艾滋病和新冠病毒的超级药物，也是一种能治疗多种癌症的有效药物。阿兹夫定的潜力远远没有挖掘出来。拓新药业作为阿兹夫定原料药及阿兹夫定药的唯一生产者前景广阔。
肿瘤学，2022 年 2 月 10 日
FNC（阿兹夫定）：一种先进的抗癌疗法还是只是一个失败者？
1俄罗斯莫斯科谢切诺夫第一国立医科大学世界级研究中心“数字生物设计和个性化医疗”
2印度 Jaunpur 查基库蒂尔研究生学院动物学系内分泌研究实验室
3印度瓦拉纳西巴纳拉斯印度大学科学研究所动物学系肿瘤免疫学实验室
4莫斯科物理与技术学院医学与生物物理系，俄罗斯多尔戈普鲁德尼
5普通外科，Parirenyatwa 医院集团，哈拉雷，津巴布韦
（此文由五家机构的八名作者共同发布）
Azvudine (FNC) 是一种新型胞苷类似物，具有抗病毒和抗癌活性。这篇综述着重于其抑制病毒生命周期和癌细胞生长的潜在分子机制，并讨论了这种核苷类药物在肿瘤和恶性血液疾病的高级治疗中的应用。FNC 通过抑制 RNA 依赖性聚合酶来抑制阳性 RNA 病毒，如 HCV、EV、SARS-COV-2、HBV 和逆转录病毒，包括 HIV。它还可以抑制人类逆转录转座子中的这种酶（逆转录酶），包括人类内源性逆转录病毒（HERV）。由于反转录转座子的激活可能是持续的癌症基因组不稳定的主要因素，因此具有更高的肿瘤侵袭性，因此 FNC 有可能提高多种抗癌疗法的功效。此外，FNC 还通过抑制恶性细胞的粘附、迁移、侵袭和增殖而显示出其他方面的抗癌活性。据报道，它还参与细胞周期停滞和细胞凋亡，从而通过不同途径抑制癌症的进展。迄今为止，FNC 对癌细胞影响的基础尚未完全清楚，因此需要进一步研究以更好地了解其抗癌活性的分子机制，以支持其在肿瘤学中的医学用途。
介绍
尽管人类做出了最大努力，但癌症仍然是全球主要的死亡原因之一（2020 年约有 1000 万人死亡）。此外，癌症相关死亡的比例呈增长趋势（https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/cancer，https://www.who.int/ru/新闻室/情况说明书/详细信息/the-top-10-cause-of-death）。在过去的几十年中，已经开发了许多有效的抗癌药物，尽管它们都不能保证患者的长期生存和防止复发（1）。不同的药物具有不同的分子机制、不同的临床适应症和不同的反应率。此外，癌症经常会产生耐药性，从而对有效控制肿瘤造成障碍 ( 2 )。这强调了寻找新的癌症治疗方法、它们的适当组合和个性化的重要性 ( 3 )。
FNC（2‘-deoxy-2‘-β-fluoro-4‘-azidocytidine）（图 1）也称为 Azvudine，是一种最近开发的胞苷类似物。它是一种新的实验药物，已被证明对具有 RNA 依赖性聚合酶的病毒和反转录转座子具有活性，以及在动物模型中对癌细胞系和异种移植物具有活性( 4-6 )。FNC 的抗癌活性至少部分与其抑制已形成约 30-40% 的人类 DNA ( 7 , 8 ) 的反转录转座子有关。据报道，包括 HERV 在内的反转录转座子的转录激活是多种系统性细胞内因子的结果（9) 例如应激反应、表观遗传重编程和由激素、生长因子和细胞因子触发的细胞内通路 ( 10)。
反转录转座子和 HERV 的表达在正常细胞中受到严格控制，其中大部分元件被转录抑制 ( 11 )。然而，在癌细胞中，由于表观遗传和转录控制的总体失调，反转录转座子和 HERV 的转录重新激活很强，它们也发挥主要基因组调控元件的作用 ( 12 )。许多癌症类型被证明与反转录转座子和 HERV 的再激活有关：乳腺癌 ( 13)、前列腺癌 ( 14 )、黑色素瘤 ( 15 )、卵巢癌 ( 16 )、肝细胞癌 ( 17 )、生殖细胞肿瘤 ( 18 ))、肾细胞癌 ( 19、20 ) 、白血病 ( 21 )、胶质母细胞瘤 ( 22 ) 和骨肉瘤 ( 23 )。反转录转座子可以通过不同的机制驱动肿瘤发生。
它们的生命周期包括其基因组拷贝的转录和相应RNA的进一步逆转录，即在RNA模板上生成cDNA拷贝（图2A）。然后逆转录的 cDNA 整合到一个新的基因组位点以产生一个新的反转录转座子副本。大多数这样的拷贝积累了突变，并且如果有的话，只包含中断/截断的非功能性开放阅读框（24）。然而，有一小部分具有功能性逆转录酶 (RT) 基因 ( 25 ) 的数百个活跃人类反转录转座子，因此可以介导新拷贝的基因组插入 ( 25）。有趣的是，大部分活跃的人类反转录转座子是由不编码 RT 而是利用其他元素的逆转录酶增殖的元素呈现的。实际上，Alu 和 SVA 家族的活性非自主反转录转座子的数量比具有全功能 RT 的自主元件的数量高一到两个数量级 ( 26 )。它们在癌症中的功能再激活可导致逆转录转座事件的显着增加，即它们的新基因组拷贝的产生 ( 27 )。有趣的是，在其他长期压力条件下也观察到类似的效果，例如 HIV 的逆转录病毒感染 ( 28 )。
图 1 2‘-Deoxy-2‘-β-fluoro-4‘-azidocytidine (FNC) 结构。
图2 （A）反转录转座子/HERV生命周期示意图；(B) FNC 触发的链终止机制。FNC 的 3‘-OH 基团不太可能被聚合酶用于延长前病毒 RNA 合成。（C）通过多种分子途径表征 FNC 的抗肿瘤机制。FNC 通过减少 Bcl-xL 和 Bcl-2 以及激活 caspase-3 来促进细胞凋亡，caspase-3 进一步调节许多关键蛋白（如 PARP）的蛋白水解切割。FNC通过上调E-cadherin和GSK-3β蛋白的表达，下调β-catenin、VEGF、MMP-2等蛋白的表达，抑制Raji和JeKo-1细胞系的粘附、迁移和侵袭和 MMP-9。Wnt/β-catenin信号通路在多种癌症的发生和促进中具有至关重要的地位。激活的 Wnt/β-catenin 改变 E-cadherin-β-catenin 复合物的表达与肿瘤细胞的侵袭性显着相关。FNC 是一种细胞周期非特异性药物，可导致 G1/S 或 G2/M 期细胞周期停滞并诱导细胞凋亡。(D)图形应该提到的是，所有人类反转录转座子都是在基因组中以数百或数千个拷贝呈现的重复序列 ( 29 )。它们总共占据了人类 DNA 的近 40%，可以作为重组的底物，尤其是与新插入的拷贝 ( 8 )。这种重组在 DNA 修复机制功能异常的癌症中尤其频繁发生 ( 30 )。这些重组导致各种基因组重排和基因转换事件，包括缺失、易位和扩增 ( 25 )。
或者，癌症中反转录转座子的转录再激活可导致 HERV 编码的致癌蛋白的表达，这些蛋白可影响通过细胞周期检查点，并具有融合和免疫抑制活性 ( 31 , 32 )。另一方面，多个正常沉默的反转录转座子拷贝的大量表达可能导致主要组织相容性复合物 (MHC) 分子呈递的新抗原的出现。后者可以引发特异性免疫反应 ( 33 )，这可能是一种特异性的抗癌保护机制。
如今，越来越多的证据表明，反转录转座子的表达，尤其是 HERV，与癌症表现有关 ( 17 )。此外，具有干性特征并表达 HERV 的癌细胞可能表现出对抗逆转录病毒药物治疗的敏感性 ( 10 )。
本综述重点关注 FNC 与化疗和/或免疫治疗方案联合治疗侵袭性肿瘤的潜在作用。我们认为 FNC 作为抗癌治疗剂的已知和潜在作用机制及其与其抗病毒活性的交联。
FNC的结构
FNC 是最近开发的核苷类似物 ( 1 )。核苷由核碱基和核糖或脱氧核糖残基组成，因此与正常核苷酸具有相当大的结构相似性。FNC 是具有 3‘-OH 基团的 4‘-C-取代的-2‘-脱氧核苷。它模拟 2‘-脱氧核苷，其 2‘-氟取代基提高了其在酸性介质中的稳定性 ( 34 )。4‘-C-取代的2‘-脱氧核苷保留了2‘-脱氧核苷的所有官能团。因此，FNC 可以与细胞内部产生的核苷酸竞争并入 DNA 和 RNA 链，从而导致核苷酸合成减弱，并干扰细胞生长和分裂 ( 35）。第二个位置的修饰使病毒 RNA 依赖性聚合酶对 FNC 更敏感。在这种情况下，该分子可以结合到 RNA 和 DNA 中——在第二个位置它具有氟，而不是决定糖残基类型的官能团 ( 36 )。FNC 也是脱氧胞苷激酶的首选底物，它的磷酸化效率比其原型脱氧胞苷激酶高 3 倍（36）。
FNC的药理机制
FNC 和正链 RNA 病毒
FNC 于 2009 年在许多潜在的治疗分子中首次合成，用于筛选更具体的丙型肝炎病毒 (HCV) 治疗 ( 37 )。它的疗效比以前使用的治疗高出 125 倍，而且效果更具选择性 ( 38 )。由于 HCV 经常引起慢性疾病，可能导致肝硬化或肝细胞癌，因此尽早发现这种感染以开始治疗非常重要。FNC的主要抗病毒机制被认为是抑制病毒复制。当 FNC 掺入由 HCV RNA 依赖性 RNA 聚合酶 NS5B 新合成的病毒 RNA 中时，它会导致初步链终止，因此会导致无功能的病毒基因组 RNA（图 2B）。
同样，其他病毒也可以中断依赖 RNA 的 RNA 聚合酶进行的 RNA 合成。例如，Na Xu 等人。( 6 )。首次表明 FNC 可用作广谱人类肠道病毒 (EV) 病原体的有效抑制剂。通过 EV71 病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 3Dpol 将核苷类似物插入到正或负 RNA 链中，并产生截短的病毒 RNA，如定量实时逆转录-PCR (RT-qPCR) 所示，具有高特异性和高效率. FNC 对 SARS-COV-2 的抗病毒活性也提出了相同的机制，SARS-COV-2 是另一种具有正义单链 RNA 基因组的病毒 ( 39 )。
FNC 和逆转录病毒
FNC 还可以作为核苷逆转录酶抑制剂 (NRTI) 发挥作用，是治疗逆转录病毒感染的潜在有效药物。作为细胞核苷酸激酶的首选靶标，氟核苷可以作为 RNA 和 DNA 聚合酶的良好底物。核苷类似物的三磷酸与细胞内源性脱氧核糖核苷酸竞争在复制过程中掺入 DNA。FNC 模拟 dN，病毒和细胞复制复合物都可能错误地将其包含在新合成的链中。FNC 的 3‘-OH 基团不太可能被聚合酶用于延长病毒 DNA 合成，并可能通过阻止核苷酸残基的进一步添加而导致复制链立即终止（40）。由于其化学修饰，FNC 靶向病毒 RNA 依赖性聚合酶，这就是它具有低细胞毒性的原因 ( 6 )。
迄今为止，FNC 正处于针对许多感染因子的临床和临床前试验的不同阶段，并且是一种获批的抗 HIV 药物 - Azvudine ( 6 )。新出现的耐药病毒株以及长期毒性是当前抗病毒化疗的主要问题 ( 41 )。与以前的 NRTIs（例如，拉米夫定）不同，对 FNC 的耐药性的发展需要不同类型的基因突变。因此，FNC 可以纳入抗艾滋病治疗管道，以克服其他药物的耐药性问题 ( 42 )。
除了对 NRTI 抗性和多重抗性 HIV 菌株具有纳摩尔活性外，还注意到 FNC 对 HIV-1 野生型菌株非常有效，没有明显的细胞毒性 ( 43 )。阿兹夫定在体外也被证明对 HIV-2 有效( 44 )，并显示出对 HIV 感染的长期抑制作用。Sun等人提出了一种可能的机制。( 40 )：在 FNC 治疗的 HIV-1 患者中，FNC 可以恢复 CD4+ T 细胞中 APOBEC3 (A3G) 的表达。FNC 与 Vif-E3 泛素连接酶复合物结合，使 APOBEC3 能够避免 Vif 诱导的泛素化和降解。反过来，APOBEC3 可以有效地限制病毒复制（45）。此外，FNC 在 HIV-1 靶细胞中表现出选择性进入和长期保留。
由于类似的传播途径，近十分之一的 HIV 患者也感染了乙型肝炎病毒 (HBV)。重要的是，FNC在体外和体内均显示可限制人和鸭乙型肝炎病毒（分别为 HBV 和 DHBV）的增殖（46）。此外，FNC 对野生型和对拉米夫定耐药的 HBV 临床分离株均有效（47）。同时，FNC 显示出低细胞毒性，因此意味着治疗的可接受的副作用。例如，对人肝癌细胞系 HepG2 的细胞毒性测试表明，即使在 1,000 μM 的浓度下，FNC 也不会导致细胞活力降低 50%，这比之前一些治疗中的生理浓度高约 200 倍 ( 47 ) . 组织病理学分析也证明了 FNC 的肝脏保护作用——观察到较少的病毒引起的肝脏损伤 ( 5 )。
FNC与癌症
癌细胞也可能受到 FNC 的特异性影响（表 1）。首先，FNC 作为一种抗病毒药物，可以抑制许多具有致癌作用的病毒的活性。此外，作为核苷酸类似物，FNC 表现出抑制细胞生长和癌细胞的活跃增殖，显然，穿透合成的核酸链并导致链终止 ( 49 )。证明了表达 HERV 的肿瘤起始（干）细胞对抗逆转录病毒药物治疗的敏感性（10). 具体来说，HERV-K 用于 CD133 阳性黑色素瘤干细胞的维持和可塑性。如 Giovavinazzo 等人所示，用逆转录酶抑制剂如叠氮胸苷 (AZT) 和依非韦伦 (EFV) 治疗肺腺癌细胞 A549 和肝癌 HepG2 可减少克隆形成、细胞生长并诱导细胞凋亡。此外，细胞的不同信号通路存在很多副作用，其机制需要进一步研究。
摘要，描述了 FNC 抗癌和抗病毒活性的可能机制。
FNC 可以通过以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞的粘附、迁移和侵袭来抑制肿瘤进展 ( 50 )。这已在非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系 H460 和两种人类侵袭性非霍奇金淋巴瘤细胞系 Raji 和 JeKo-1的体外和体内得到证实。这两个系列的实验都表明，在 FNC 治疗后，MMP-2、MMP-9 和 VEGF 的表达水平受到抑制，而 E-cadherin 表达水平增加。后来，Zhang 及其同事 ( 51 ) 还报道了 FNC 治疗后 GSK-3β 表达增加，并得出结论认为 FNC 通过调节侵袭性非霍奇金淋巴瘤的侵袭和转移可能被认为是一种有效的化学治疗剂。通过抑制 Wnt/β-catenin 信号通路。
FNC对癌细胞影响的大多数研究方面都以剂量和时间依赖性方式发生。它被认为通过抑制 CDKN1A、PML、TP53INP1、TNF、SPN 和 LST1 蛋白的表达来抑制细胞生长 ( 4 )。FNC 还调节细胞周期。它可能在不同浓度下引起不同时期的细胞周期停滞。基因表达分析表明，PRNP、TP53INP1、PRKAG2、SESN2、SESN3、ERN1、CDKN1A、PML和TCF7L2基因与 G1/S 或 G2/M 期的细胞周期停滞有关 ( 4 )。FNC 还可以通过调节 DNA 甲基化来影响基因表达 ( 50 )。
肿瘤的生长和发育不仅受增殖活性和细胞生长速率的调节，还受凋亡过程强度的调节。据报道，对于不同类型的癌症， FNC 通过触发细胞死亡受体介导的外在途径 ( 4 ) 和线粒体凋亡途径 ( 50 ) 来诱导细胞凋亡。在第一种情况下，FNC 治疗显着增加了 Fas、FasL 和 TNF-α 的蛋白质表达。此外，张等人。( 4 ) 发现FNC处理也影响其他一些在细胞凋亡中起作用的基因的表达水平：CDKN1A、PML、BIRC3、CASP10和TNF-α. 在第二种情况下，用 FNC 处理 H460 细胞可抑制 Bcl-2 表达并增强细胞色素 C (Cyt-C) 释放、Bax 和 caspase-3 表达。
调节免疫系统可能是 FNC 的另一个重要抗肿瘤机制，应进行研究。在一项比较有和没有 FNC 治疗的基因表达谱的研究中，显示了与免疫相关的几个基因的表达发生了显着变化。基于 Biocarta ( 4 ) 已显示 T 细胞活化期间的共刺激信号和与 IL-2、IL-4、IL-7、IL-10 途径相关的基因。此外，一些 HERV 也已证明对免疫系统有影响：逆转录病毒序列翻译的蛋白质产物，例如 HERV-K 基因的 Gag，会影响癌细胞与免疫系统的相互作用 ( 14 , 19）。逆转录病毒的活性和代谢物，由肿瘤微环境分泌，诱导免疫抑制活性以及癌细胞干的其他特性 ( 10 )。HERVs 还诱导局部免疫检查点激活 ( 19 )。因此，通过 FNC 抑制逆转录病毒活性可以提高免疫治疗策略的有效性。实际上，CAR-T 细胞靶向 HERV-K 包膜蛋白已被报道为黑色素瘤和其他肿瘤的潜在免疫治疗方法 ( 52 )。
FNC对细胞生长、细胞周期阻滞和凋亡的多效性作用可以由独立的原因介导，也可以由共同的功能节点介导。例如，PML 和 CDKN1A 都与上述所有过程有关（4）。这表明 FNC 可能是一种有效的多效性分子，可用于治疗癌症的多种病理状况（图 2C）。然而，这些研究可能被认为是零碎的，因为它们没有提供与 FNC 效应相关的全面的高通量基因表达分析。因此，对FNC对细胞周期和细胞凋亡的分子作用机制进行一系列更深入的研究，对于支持其在癌症治疗中的潜在应用至关重要。
因此，FNC可以抑制肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭和增殖，参与细胞周期阻滞、免疫系统进程和细胞凋亡，从而抑制癌症的进展。因此，FNC可能通过多种分子途径影响肿瘤的发生和发展。对于大多数这些过程，已经表明 FNC 的影响以剂量和时间依赖性方式发生。
FNC 的有效性已在体外和体内对 NSCLC 和肺腺癌 ( 50 )、非霍奇金淋巴瘤 ( 49 )、急性髓性白血病 ( 1 ) 和小鼠肝癌异种移植模型 (H22 )、肉瘤 (S180) 和胃癌 (SGC7901) ( 1 )。
同时，FNC 表现出相对较低的毒性。例如，在 SCID 小鼠 ( 4 ) 的套细胞淋巴瘤实验中，与阴性对照组相比，低剂量和中剂量 FNC 组没有表现出显着的体重减轻。对肝脏和肾脏组织的进一步组织病理学检查未发现药物毒性迹象。
FNC的临床试验
FNC 对 NRTI 抗性和多重抗性 HIV 毒株具有纳摩尔活性。这很可能是由于对先前使用的 NRTIs 和 FNC 的病毒抗性涉及不同的突变。事实上，王等人。分析了对 FNC 或上一代 NRTI（3TC – 拉米夫定）具有抗性的 HIV 毒株，发现在 3TC 抗性病毒中，显性突变是 M184V（缬氨酸取代了逆转录酶基因第 184 位的蛋氨酸），仅在~2% 的 FNC 抗性菌株 ( 44 )。反过来，FNC 抗性克隆增加了 M184I 突变率 ( 44 )。
在“Azvudine vs HIV-infection/AIDS, Phase II (NCT04109183)”试验中，FNC 以片剂形式给药。这是一项 II 期多中心、随机、双盲、双模拟、阳性对照试验，有 172 名参与者。受试者被随机分配到 3TC（阳性对照）或不同剂量（每片 2 至 4 毫克）的 FNC 治疗组。背景药物（逆转录酶抑制剂治疗）是依法韦仑和富马酸替诺福韦酯。FNC 没有显示出严重的不良反应，表现出理想的药代动力学，并达到了疗效终点 ( 39 )，从而为第三阶段试验奠定了基础。
其中一项此类试验已于 2020 年 3 月由中国的 HeNanSincere Biotech 启动（阿兹夫定在 HIV 感染初治患者中的 III 期临床研究，NCT04303598）。根据前一阶段的结果，选择了3毫克活性成分片剂的最佳剂量。这是一项随机、双盲、双模拟、主动对照的 III 期试验，有 720 名参与者参加，评估阿兹夫定联合富马酸替诺福韦和依非韦伦对 HIV 感染治疗初治患者的疗效和安全性。联合治疗中的 FNC 与 3TC 进行比较，预计完成日期为 2022 年 8 月。
或者，评估阿兹夫定对抗 SARS-COV-2 的第三阶段临床试验于 2021 年 4 月开始，预计将于 2021 年 12 月完成。FNC 在临床前试验中已成功对抗这种感染（53）。后来在一项 FNC 治疗轻度和普通 COVID-19 的随机、开放标签、对照临床试验（一项试点研究）中发现，FNC 治疗轻度和普通 COVID-19 患者可能会缩短核酸时间根据中国国家卫健委发布的《诊疗方案试行第五版（或第六版）指南》，酸转阴转对比标准抗病毒治疗。该期限平均减少了 4.5 天。在试验的第一阶段，攀爬测试表明 6 mg FNC 仍然是安全剂量，因此选择每天 5 mg 的剂量进行进一步评估。在接受 FNC 治疗的患者中未观察到与药物相关的不良反应，而在接受标准抗病毒药物治疗后约为 30% ( 53 )。
结论
总体而言，FNC 是一种具有抗病毒和抗癌活性的新型核苷类似物（图 2D）。对具有正链 RNA 基因组的 HCV、EV 和 SARS-COV-2 等病毒是有效的药物。另一方面，它属于核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTIs) 组，可以抑制 HIV 和很可能其他含有病毒和转座因子的逆转录酶，包括逆转录转座子和 HERV。最后，FNC 显示出相当大的抗癌活性，理论上这可能是由于细胞周期衰减和反转录转座子/HERV 的抑制。需要评估 FNC 治疗与 TK/更昔洛韦或 5FC/CD 前药系统的可能组合是否可以改善这些效果。
作者贡献
DF，概念化，方法论，调查，写作 - 原稿，写作 - 审查和编辑。RK，概念化，写作 - 原稿，可视化。AA，概念化，写作 - 原稿，可视化。AB，写作 - 原稿，写作 - 审查和编辑。注意，写作，概念化，可视化。PT，-审查。IU，概念化，监督，写作-评论。BK，评论。所有作者都对文章做出了贡献并批准了提交的版本。
资金
这项工作得到了俄罗斯科学基金会第 21-15- hk00213 号赠款（IU，分子机制描述，FNC 的抗病毒活性，临床试验）和 21-74-20066 号赠款（NB，FNC 的抗癌活性）的支持。
利益冲突
作者 AB 受雇于 OmicsWay Corp., Walnut, CA, 91789, USA。
其余作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
出版商注
本文中表达的所有主张仅代表作者的主张，并不一定代表其附属组织或出版商、编辑和审稿人的主张。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，均不受出版商的保证或认可。
肿瘤学，2022 年 2 月 10 日
FNC（阿兹夫定）：一种先进的抗癌疗法还是只是一个失败者？
1俄罗斯莫斯科谢切诺夫第一国立医科大学世界级研究中心“数字生物设计和个性化医疗”
2印度 Jaunpur 查基库蒂尔研究生学院动物学系内分泌研究实验室
3印度瓦拉纳西巴纳拉斯印度大学科学研究所动物学系肿瘤免疫学实验室
4莫斯科物理与技术学院医学与生物物理系，俄罗斯多尔戈普鲁德尼
5普通外科，Parirenyatwa 医院集团，哈拉雷，津巴布韦
（此文由五家机构的八名作者共同发布）
Azvudine (FNC) 是一种新型胞苷类似物，具有抗病毒和抗癌活性。这篇综述着重于其抑制病毒生命周期和癌细胞生长的潜在分子机制，并讨论了这种核苷类药物在肿瘤和恶性血液疾病的高级治疗中的应用。FNC 通过抑制 RNA 依赖性聚合酶来抑制阳性 RNA 病毒，如 HCV、EV、SARS-COV-2、HBV 和逆转录病毒，包括 HIV。它还可以抑制人类逆转录转座子中的这种酶（逆转录酶），包括人类内源性逆转录病毒（HERV）。由于反转录转座子的激活可能是持续的癌症基因组不稳定的主要因素，因此具有更高的肿瘤侵袭性，因此 FNC 有可能提高多种抗癌疗法的功效。此外，FNC 还通过抑制恶性细胞的粘附、迁移、侵袭和增殖而显示出其他方面的抗癌活性。据报道，它还参与细胞周期停滞和细胞凋亡，从而通过不同途径抑制癌症的进展。迄今为止，FNC 对癌细胞影响的基础尚未完全清楚，因此需要进一步研究以更好地了解其抗癌活性的分子机制，以支持其在肿瘤学中的医学用途。
介绍
尽管人类做出了最大努力，但癌症仍然是全球主要的死亡原因之一（2020 年约有 1000 万人死亡）。此外，癌症相关死亡的比例呈增长趋势（https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/cancer，https://www.who.int/ru/新闻室/情况说明书/详细信息/the-top-10-cause-of-death）。在过去的几十年中，已经开发了许多有效的抗癌药物，尽管它们都不能保证患者的长期生存和防止复发（1）。不同的药物具有不同的分子机制、不同的临床适应症和不同的反应率。此外，癌症经常会产生耐药性，从而对有效控制肿瘤造成障碍 ( 2 )。这强调了寻找新的癌症治疗方法、它们的适当组合和个性化的重要性 ( 3 )。
FNC（2‘-deoxy-2‘-β-fluoro-4‘-azidocytidine）（图 1）也称为 Azvudine，是一种最近开发的胞苷类似物。它是一种新的实验药物，已被证明对具有 RNA 依赖性聚合酶的病毒和反转录转座子具有活性，以及在动物模型中对癌细胞系和异种移植物具有活性( 4-6 )。FNC 的抗癌活性至少部分与其抑制已形成约 30-40% 的人类 DNA ( 7 , 8 ) 的反转录转座子有关。据报道，包括 HERV 在内的反转录转座子的转录激活是多种系统性细胞内因子的结果（9) 例如应激反应、表观遗传重编程和由激素、生长因子和细胞因子触发的细胞内通路 ( 10)。
反转录转座子和 HERV 的表达在正常细胞中受到严格控制，其中大部分元件被转录抑制 ( 11 )。然而，在癌细胞中，由于表观遗传和转录控制的总体失调，反转录转座子和 HERV 的转录重新激活很强，它们也发挥主要基因组调控元件的作用 ( 12 )。许多癌症类型被证明与反转录转座子和 HERV 的再激活有关：乳腺癌 ( 13)、前列腺癌 ( 14 )、黑色素瘤 ( 15 )、卵巢癌 ( 16 )、肝细胞癌 ( 17 )、生殖细胞肿瘤 ( 18 ))、肾细胞癌 ( 19、20 ) 、白血病 ( 21 )、胶质母细胞瘤 ( 22 ) 和骨肉瘤 ( 23 )。反转录转座子可以通过不同的机制驱动肿瘤发生。
它们的生命周期包括其基因组拷贝的转录和相应RNA的进一步逆转录，即在RNA模板上生成cDNA拷贝（图2A）。然后逆转录的 cDNA 整合到一个新的基因组位点以产生一个新的反转录转座子副本。大多数这样的拷贝积累了突变，并且如果有的话，只包含中断/截断的非功能性开放阅读框（24）。然而，有一小部分具有功能性逆转录酶 (RT) 基因 ( 25 ) 的数百个活跃人类反转录转座子，因此可以介导新拷贝的基因组插入 ( 25）。有趣的是，大部分活跃的人类反转录转座子是由不编码 RT 而是利用其他元素的逆转录酶增殖的元素呈现的。实际上，Alu 和 SVA 家族的活性非自主反转录转座子的数量比具有全功能 RT 的自主元件的数量高一到两个数量级 ( 26 )。它们在癌症中的功能再激活可导致逆转录转座事件的显着增加，即它们的新基因组拷贝的产生 ( 27 )。有趣的是，在其他长期压力条件下也观察到类似的效果，例如 HIV 的逆转录病毒感染 ( 28 )。
图 1 2‘-Deoxy-2‘-β-fluoro-4‘-azidocytidine (FNC) 结构。
图2 （A）反转录转座子/HERV生命周期示意图；(B) FNC 触发的链终止机制。FNC 的 3‘-OH 基团不太可能被聚合酶用于延长前病毒 RNA 合成。（C）通过多种分子途径表征 FNC 的抗肿瘤机制。FNC 通过减少 Bcl-xL 和 Bcl-2 以及激活 caspase-3 来促进细胞凋亡，caspase-3 进一步调节许多关键蛋白（如 PARP）的蛋白水解切割。FNC通过上调E-cadherin和GSK-3β蛋白的表达，下调β-catenin、VEGF、MMP-2等蛋白的表达，抑制Raji和JeKo-1细胞系的粘附、迁移和侵袭和 MMP-9。Wnt/β-catenin信号通路在多种癌症的发生和促进中具有至关重要的地位。激活的 Wnt/β-catenin 改变 E-cadherin-β-catenin 复合物的表达与肿瘤细胞的侵袭性显着相关。FNC 是一种细胞周期非特异性药物，可导致 G1/S 或 G2/M 期细胞周期停滞并诱导细胞凋亡。(D)图形应该提到的是，所有人类反转录转座子都是在基因组中以数百或数千个拷贝呈现的重复序列 ( 29 )。它们总共占据了人类 DNA 的近 40%，可以作为重组的底物，尤其是与新插入的拷贝 ( 8 )。这种重组在 DNA 修复机制功能异常的癌症中尤其频繁发生 ( 30 )。这些重组导致各种基因组重排和基因转换事件，包括缺失、易位和扩增 ( 25 )。
或者，癌症中反转录转座子的转录再激活可导致 HERV 编码的致癌蛋白的表达，这些蛋白可影响通过细胞周期检查点，并具有融合和免疫抑制活性 ( 31 , 32 )。另一方面，多个正常沉默的反转录转座子拷贝的大量表达可能导致主要组织相容性复合物 (MHC) 分子呈递的新抗原的出现。后者可以引发特异性免疫反应 ( 33 )，这可能是一种特异性的抗癌保护机制。
如今，越来越多的证据表明，反转录转座子的表达，尤其是 HERV，与癌症表现有关 ( 17 )。此外，具有干性特征并表达 HERV 的癌细胞可能表现出对抗逆转录病毒药物治疗的敏感性 ( 10 )。
本综述重点关注 FNC 与化疗和/或免疫治疗方案联合治疗侵袭性肿瘤的潜在作用。我们认为 FNC 作为抗癌治疗剂的已知和潜在作用机制及其与其抗病毒活性的交联。
FNC的结构
FNC 是最近开发的核苷类似物 ( 1 )。核苷由核碱基和核糖或脱氧核糖残基组成，因此与正常核苷酸具有相当大的结构相似性。FNC 是具有 3‘-OH 基团的 4‘-C-取代的-2‘-脱氧核苷。它模拟 2‘-脱氧核苷，其 2‘-氟取代基提高了其在酸性介质中的稳定性 ( 34 )。4‘-C-取代的2‘-脱氧核苷保留了2‘-脱氧核苷的所有官能团。因此，FNC 可以与细胞内部产生的核苷酸竞争并入 DNA 和 RNA 链，从而导致核苷酸合成减弱，并干扰细胞生长和分裂 ( 35）。第二个位置的修饰使病毒 RNA 依赖性聚合酶对 FNC 更敏感。在这种情况下，该分子可以结合到 RNA 和 DNA 中——在第二个位置它具有氟，而不是决定糖残基类型的官能团 ( 36 )。FNC 也是脱氧胞苷激酶的首选底物，它的磷酸化效率比其原型脱氧胞苷激酶高 3 倍（36）。
FNC的药理机制
FNC 和正链 RNA 病毒
FNC 于 2009 年在许多潜在的治疗分子中首次合成，用于筛选更具体的丙型肝炎病毒 (HCV) 治疗 ( 37 )。它的疗效比以前使用的治疗高出 125 倍，而且效果更具选择性 ( 38 )。由于 HCV 经常引起慢性疾病，可能导致肝硬化或肝细胞癌，因此尽早发现这种感染以开始治疗非常重要。FNC的主要抗病毒机制被认为是抑制病毒复制。当 FNC 掺入由 HCV RNA 依赖性 RNA 聚合酶 NS5B 新合成的病毒 RNA 中时，它会导致初步链终止，因此会导致无功能的病毒基因组 RNA（图 2B）。
同样，其他病毒也可以中断依赖 RNA 的 RNA 聚合酶进行的 RNA 合成。例如，Na Xu 等人。( 6 )。首次表明 FNC 可用作广谱人类肠道病毒 (EV) 病原体的有效抑制剂。通过 EV71 病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 3Dpol 将核苷类似物插入到正或负 RNA 链中，并产生截短的病毒 RNA，如定量实时逆转录-PCR (RT-qPCR) 所示，具有高特异性和高效率. FNC 对 SARS-COV-2 的抗病毒活性也提出了相同的机制，SARS-COV-2 是另一种具有正义单链 RNA 基因组的病毒 ( 39 )。
FNC 和逆转录病毒
FNC 还可以作为核苷逆转录酶抑制剂 (NRTI) 发挥作用，是治疗逆转录病毒感染的潜在有效药物。作为细胞核苷酸激酶的首选靶标，氟核苷可以作为 RNA 和 DNA 聚合酶的良好底物。核苷类似物的三磷酸与细胞内源性脱氧核糖核苷酸竞争在复制过程中掺入 DNA。FNC 模拟 dN，病毒和细胞复制复合物都可能错误地将其包含在新合成的链中。FNC 的 3‘-OH 基团不太可能被聚合酶用于延长病毒 DNA 合成，并可能通过阻止核苷酸残基的进一步添加而导致复制链立即终止（40）。由于其化学修饰，FNC 靶向病毒 RNA 依赖性聚合酶，这就是它具有低细胞毒性的原因 ( 6 )。
迄今为止，FNC 正处于针对许多感染因子的临床和临床前试验的不同阶段，并且是一种获批的抗 HIV 药物 - Azvudine ( 6 )。新出现的耐药病毒株以及长期毒性是当前抗病毒化疗的主要问题 ( 41 )。与以前的 NRTIs（例如，拉米夫定）不同，对 FNC 的耐药性的发展需要不同类型的基因突变。因此，FNC 可以纳入抗艾滋病治疗管道，以克服其他药物的耐药性问题 ( 42 )。
除了对 NRTI 抗性和多重抗性 HIV 菌株具有纳摩尔活性外，还注意到 FNC 对 HIV-1 野生型菌株非常有效，没有明显的细胞毒性 ( 43 )。阿兹夫定在体外也被证明对 HIV-2 有效( 44 )，并显示出对 HIV 感染的长期抑制作用。Sun等人提出了一种可能的机制。( 40 )：在 FNC 治疗的 HIV-1 患者中，FNC 可以恢复 CD4+ T 细胞中 APOBEC3 (A3G) 的表达。FNC 与 Vif-E3 泛素连接酶复合物结合，使 APOBEC3 能够避免 Vif 诱导的泛素化和降解。反过来，APOBEC3 可以有效地限制病毒复制（45）。此外，FNC 在 HIV-1 靶细胞中表现出选择性进入和长期保留。
由于类似的传播途径，近十分之一的 HIV 患者也感染了乙型肝炎病毒 (HBV)。重要的是，FNC在体外和体内均显示可限制人和鸭乙型肝炎病毒（分别为 HBV 和 DHBV）的增殖（46）。此外，FNC 对野生型和对拉米夫定耐药的 HBV 临床分离株均有效（47）。同时，FNC 显示出低细胞毒性，因此意味着治疗的可接受的副作用。例如，对人肝癌细胞系 HepG2 的细胞毒性测试表明，即使在 1,000 μM 的浓度下，FNC 也不会导致细胞活力降低 50%，这比之前一些治疗中的生理浓度高约 200 倍 ( 47 ) . 组织病理学分析也证明了 FNC 的肝脏保护作用——观察到较少的病毒引起的肝脏损伤 ( 5 )。
FNC与癌症
癌细胞也可能受到 FNC 的特异性影响（表 1）。首先，FNC 作为一种抗病毒药物，可以抑制许多具有致癌作用的病毒的活性。此外，作为核苷酸类似物，FNC 表现出抑制细胞生长和癌细胞的活跃增殖，显然，穿透合成的核酸链并导致链终止 ( 49 )。证明了表达 HERV 的肿瘤起始（干）细胞对抗逆转录病毒药物治疗的敏感性（10). 具体来说，HERV-K 用于 CD133 阳性黑色素瘤干细胞的维持和可塑性。如 Giovavinazzo 等人所示，用逆转录酶抑制剂如叠氮胸苷 (AZT) 和依非韦伦 (EFV) 治疗肺腺癌细胞 A549 和肝癌 HepG2 可减少克隆形成、细胞生长并诱导细胞凋亡。此外，细胞的不同信号通路存在很多副作用，其机制需要进一步研究。
摘要，描述了 FNC 抗癌和抗病毒活性的可能机制。
FNC 可以通过以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞的粘附、迁移和侵袭来抑制肿瘤进展 ( 50 )。这已在非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系 H460 和两种人类侵袭性非霍奇金淋巴瘤细胞系 Raji 和 JeKo-1的体外和体内得到证实。这两个系列的实验都表明，在 FNC 治疗后，MMP-2、MMP-9 和 VEGF 的表达水平受到抑制，而 E-cadherin 表达水平增加。后来，Zhang 及其同事 ( 51 ) 还报道了 FNC 治疗后 GSK-3β 表达增加，并得出结论认为 FNC 通过调节侵袭性非霍奇金淋巴瘤的侵袭和转移可能被认为是一种有效的化学治疗剂。通过抑制 Wnt/β-catenin 信号通路。
FNC对癌细胞影响的大多数研究方面都以剂量和时间依赖性方式发生。它被认为通过抑制 CDKN1A、PML、TP53INP1、TNF、SPN 和 LST1 蛋白的表达来抑制细胞生长 ( 4 )。FNC 还调节细胞周期。它可能在不同浓度下引起不同时期的细胞周期停滞。基因表达分析表明，PRNP、TP53INP1、PRKAG2、SESN2、SESN3、ERN1、CDKN1A、PML和TCF7L2基因与 G1/S 或 G2/M 期的细胞周期停滞有关 ( 4 )。FNC 还可以通过调节 DNA 甲基化来影响基因表达 ( 50 )。
肿瘤的生长和发育不仅受增殖活性和细胞生长速率的调节，还受凋亡过程强度的调节。据报道，对于不同类型的癌症， FNC 通过触发细胞死亡受体介导的外在途径 ( 4 ) 和线粒体凋亡途径 ( 50 ) 来诱导细胞凋亡。在第一种情况下，FNC 治疗显着增加了 Fas、FasL 和 TNF-α 的蛋白质表达。此外，张等人。( 4 ) 发现FNC处理也影响其他一些在细胞凋亡中起作用的基因的表达水平：CDKN1A、PML、BIRC3、CASP10和TNF-α. 在第二种情况下，用 FNC 处理 H460 细胞可抑制 Bcl-2 表达并增强细胞色素 C (Cyt-C) 释放、Bax 和 caspase-3 表达。
调节免疫系统可能是 FNC 的另一个重要抗肿瘤机制，应进行研究。在一项比较有和没有 FNC 治疗的基因表达谱的研究中，显示了与免疫相关的几个基因的表达发生了显着变化。基于 Biocarta ( 4 ) 已显示 T 细胞活化期间的共刺激信号和与 IL-2、IL-4、IL-7、IL-10 途径相关的基因。此外，一些 HERV 也已证明对免疫系统有影响：逆转录病毒序列翻译的蛋白质产物，例如 HERV-K 基因的 Gag，会影响癌细胞与免疫系统的相互作用 ( 14 , 19）。逆转录病毒的活性和代谢物，由肿瘤微环境分泌，诱导免疫抑制活性以及癌细胞干的其他特性 ( 10 )。HERVs 还诱导局部免疫检查点激活 ( 19 )。因此，通过 FNC 抑制逆转录病毒活性可以提高免疫治疗策略的有效性。实际上，CAR-T 细胞靶向 HERV-K 包膜蛋白已被报道为黑色素瘤和其他肿瘤的潜在免疫治疗方法 ( 52 )。
FNC对细胞生长、细胞周期阻滞和凋亡的多效性作用可以由独立的原因介导，也可以由共同的功能节点介导。例如，PML 和 CDKN1A 都与上述所有过程有关（4）。这表明 FNC 可能是一种有效的多效性分子，可用于治疗癌症的多种病理状况（图 2C）。然而，这些研究可能被认为是零碎的，因为它们没有提供与 FNC 效应相关的全面的高通量基因表达分析。因此，对FNC对细胞周期和细胞凋亡的分子作用机制进行一系列更深入的研究，对于支持其在癌症治疗中的潜在应用至关重要。
因此，FNC可以抑制肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭和增殖，参与细胞周期阻滞、免疫系统进程和细胞凋亡，从而抑制癌症的进展。因此，FNC可能通过多种分子途径影响肿瘤的发生和发展。对于大多数这些过程，已经表明 FNC 的影响以剂量和时间依赖性方式发生。
FNC 的有效性已在体外和体内对 NSCLC 和肺腺癌 ( 50 )、非霍奇金淋巴瘤 ( 49 )、急性髓性白血病 ( 1 ) 和小鼠肝癌异种移植模型 (H22 )、肉瘤 (S180) 和胃癌 (SGC7901) ( 1 )。
同时，FNC 表现出相对较低的毒性。例如，在 SCID 小鼠 ( 4 ) 的套细胞淋巴瘤实验中，与阴性对照组相比，低剂量和中剂量 FNC 组没有表现出显着的体重减轻。对肝脏和肾脏组织的进一步组织病理学检查未发现药物毒性迹象。
FNC的临床试验
FNC 对 NRTI 抗性和多重抗性 HIV 毒株具有纳摩尔活性。这很可能是由于对先前使用的 NRTIs 和 FNC 的病毒抗性涉及不同的突变。事实上，王等人。分析了对 FNC 或上一代 NRTI（3TC – 拉米夫定）具有抗性的 HIV 毒株，发现在 3TC 抗性病毒中，显性突变是 M184V（缬氨酸取代了逆转录酶基因第 184 位的蛋氨酸），仅在~2% 的 FNC 抗性菌株 ( 44 )。反过来，FNC 抗性克隆增加了 M184I 突变率 ( 44 )。
在“Azvudine vs HIV-infection/AIDS, Phase II (NCT04109183)”试验中，FNC 以片剂形式给药。这是一项 II 期多中心、随机、双盲、双模拟、阳性对照试验，有 172 名参与者。受试者被随机分配到 3TC（阳性对照）或不同剂量（每片 2 至 4 毫克）的 FNC 治疗组。背景药物（逆转录酶抑制剂治疗）是依法韦仑和富马酸替诺福韦酯。FNC 没有显示出严重的不良反应，表现出理想的药代动力学，并达到了疗效终点 ( 39 )，从而为第三阶段试验奠定了基础。
其中一项此类试验已于 2020 年 3 月由中国的 HeNanSincere Biotech 启动（阿兹夫定在 HIV 感染初治患者中的 III 期临床研究，NCT04303598）。根据前一阶段的结果，选择了3毫克活性成分片剂的最佳剂量。这是一项随机、双盲、双模拟、主动对照的 III 期试验，有 720 名参与者参加，评估阿兹夫定联合富马酸替诺福韦和依非韦伦对 HIV 感染治疗初治患者的疗效和安全性。联合治疗中的 FNC 与 3TC 进行比较，预计完成日期为 2022 年 8 月。
或者，评估阿兹夫定对抗 SARS-COV-2 的第三阶段临床试验于 2021 年 4 月开始，预计将于 2021 年 12 月完成。FNC 在临床前试验中已成功对抗这种感染（53）。后来在一项 FNC 治疗轻度和普通 COVID-19 的随机、开放标签、对照临床试验（一项试点研究）中发现，FNC 治疗轻度和普通 COVID-19 患者可能会缩短核酸时间根据中国国家卫健委发布的《诊疗方案试行第五版（或第六版）指南》，酸转阴转对比标准抗病毒治疗。该期限平均减少了 4.5 天。在试验的第一阶段，攀爬测试表明 6 mg FNC 仍然是安全剂量，因此选择每天 5 mg 的剂量进行进一步评估。在接受 FNC 治疗的患者中未观察到与药物相关的不良反应，而在接受标准抗病毒药物治疗后约为 30% ( 53 )。
结论
总体而言，FNC 是一种具有抗病毒和抗癌活性的新型核苷类似物（图 2D）。对具有正链 RNA 基因组的 HCV、EV 和 SARS-COV-2 等病毒是有效的药物。另一方面，它属于核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTIs) 组，可以抑制 HIV 和很可能其他含有病毒和转座因子的逆转录酶，包括逆转录转座子和 HERV。最后，FNC 显示出相当大的抗癌活性，理论上这可能是由于细胞周期衰减和反转录转座子/HERV 的抑制。需要评估 FNC 治疗与 TK/更昔洛韦或 5FC/CD 前药系统的可能组合是否可以改善这些效果。
作者贡献
DF，概念化，方法论，调查，写作 - 原稿，写作 - 审查和编辑。RK，概念化，写作 - 原稿，可视化。AA，概念化，写作 - 原稿，可视化。AB，写作 - 原稿，写作 - 审查和编辑。注意，写作，概念化，可视化。PT，-审查。IU，概念化，监督，写作-评论。BK，评论。所有作者都对文章做出了贡献并批准了提交的版本。
资金
这项工作得到了俄罗斯科学基金会第 21-15- hk00213 号赠款（IU，分子机制描述，FNC 的抗病毒活性，临床试验）和 21-74-20066 号赠款（NB，FNC 的抗癌活性）的支持。
利益冲突
作者 AB 受雇于 OmicsWay Corp., Walnut, CA, 91789, USA。
其余作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
出版商注
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